哲羅鮭精子冷凍保存分析

1材料與方法

1.1實驗材料利用新疆伊犁河恰甫其海水庫養殖的哲羅鮭（Huchotaimen）親魚21多尾，培育在（3×20）m2的長方形流水養魚池中，進排水量約（15~20）m3/h，在水溫達到8℃時對雄魚注射促黃體生成素釋放激素類似物（LRH-A2）2.5µg/kg和絨毛膜促性腺激素（hu-manchorionicgonadotropin,HCG）400IU/kg催熟，雄魚成熟后采用擠壓腹部法收集精液，采精時避免光線直射，將精液直接收集在50mL玻璃瓶中，置于事先放入冰塊的保溫盒中，帶回實驗室進行冷凍保存實驗。氣相液氮罐

1.2精子稀釋液的配制和篩選利用市售NaCl、KCl、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、Na2、HPO4、NaHCO3、NaH2PO4、KHCO3、KOH、MgSO4、KH2PO4、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、Tris、胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）、N-二（羥乙基）甘氨酸（bicine）、蛋黃、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide,DMSO）配制了9種精子稀釋液和冷凍保存液：MPRS、RS、Hanks、ELS、EG1、EG2、Stein、SS-2、D15（表1）。分別利用以上精子稀釋液以1：1的比例稀釋精液，平衡5min后，利用OLYMPUS顯微鏡觀察并統計精子活力（運動精子/全部精子數）。然后分別在以上稀釋液中加入20%的DMSO，再以1：1的比例稀釋精液，平衡5min后在顯微鏡下觀察并統計精子活力。最后將稀釋后的精液分裝在2mL冷凍管中，每管注入稀釋精液1.0mL，采用三步法冷凍保存在液氮中。冷凍3~4h后，利用37℃水浴解凍精子，在顯微鏡下觀察并統計精子活力。

表1精子稀釋液配方

[精子稀釋液.jpg]

1.3抗凍劑（甲醇和二甲基亞砜）濃度的篩選以ELS為稀釋液，分別以終濃度為4%、6%、8%、10%和12%加入抗凍劑甲醇（methanol）和DMSO，稀釋精液在加入冰塊的保溫盒中平衡20min后在顯微鏡下觀察并統計精子活力。然后將稀釋精液分裝在2mL冷凍管中，每管注入稀釋精液1.0mL，采用三步法冷凍保存在液氮中。冷凍3~4h后，利用37℃水浴解凍精子，在顯微鏡下觀察并統計精子活力。

1.4葡萄糖濃度的篩選以D15為基礎稀釋液，在其中分別加入15%、20%、25%、30%、35%和40%的葡萄糖，再加入終濃度6%甲醇，以1：1的比例稀釋精液，在加入冰塊的保溫盒中平衡20min后在顯微鏡下觀察并統計精子活力。然后將稀釋精液分裝在2mL冷凍管中，每管注入稀釋精液1mL，采用三步法冷凍保存在液氮中。冷凍5h后，利用37℃水浴解凍精子，在顯微鏡下觀察并統計精子活力。氣相液氮罐

1.5哲羅鮭精子在不同稀釋液中短期冷藏保存分別以D15、D30、Stein和ELS為稀釋液，以1：1的比例稀釋哲羅鮭精液，分別注入2mL冷凍管中，每管注入1.5mL，同時以未加稀釋液的鮮精作對照，將冷凍管置于保溫盒中，保溫盒中事先放入體積1/3的冰塊，保存溫度2~4℃。每隔5h在顯微鏡下觀察統計一次精子活力，直至精子完全失活。

1.6數據統計分析利用SPSS19.0統計軟件對獲得的數據進行單因素方差分析（One-WayANOVA），采用Student-Newman-Keuls進行多重比較和差異顯著性分析，篩選精子活力最高的精子稀釋液配方、抗凍劑成份和濃度。利用Excel軟件對統計結果做圖，在圖中利用a、b、c后d等字母表示分析結果之間的顯著性差異，字母相同為無顯著性差異（P＞0.05），字母不同具顯著性差異（P＜0.05）。