分離豬胚胎多能干細(xì)胞方法

胚胎干細(xì)胞從囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離得到，具有自我更新和分化為3個胚層和生殖細(xì)胞的潛能。豬胚胎分離培養(yǎng)體系會改變細(xì)胞核移植胚胎、孤雌胚胎和體內(nèi)胚胎多能基因的表達(dá)，也會影響豬多能干細(xì)胞形成的效率和質(zhì)量。自增壓液氮罐

細(xì)胞培養(yǎng)：用于核移植供體的豬胎兒成纖維細(xì)胞從初生豬仔的耳部分離得到。細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM，15%胎牛血清，培養(yǎng)溫度為37℃。使用0.25%（W/V）的胰蛋白酶消化，中和后離心200×g。將細(xì)胞重懸后并加入等量凍存液（40%DMEM，40%FBS和20%DMSO），貯存在液氮中。

卵母細(xì)胞的收集和準(zhǔn)備：從屠宰場收集豬卵巢，保存在含有青/鏈霉素的生理鹽水中，運輸溫度32~38℃，3h內(nèi)運回實驗室。采用抽吸法采集卵巢卵母細(xì)胞。抽取3~6mm卵泡中的卵母細(xì)胞置于15mL離心管中，37℃水浴靜置數(shù)分鐘，待卵母細(xì)胞沉降后，用洗卵液洗2遍，顯微鏡下挑取顆粒細(xì)胞層達(dá)3層以上的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物，然后將COCs轉(zhuǎn)入U型皿中培養(yǎng)42~44h，每孔加500μL成熟培養(yǎng)液，每孔放置50~70枚。

孤雌激活和胚胎培養(yǎng)：用電融合儀將成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行電激活，將卵母細(xì)胞移至2mmol/L6D孵育2.5h。分別將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到胚胎培養(yǎng)基G1、NCSU23和豬受精卵培養(yǎng)基，24h后記錄卵裂率。3d后，將培養(yǎng)基G1中發(fā)育的胚胎移入囊胚培養(yǎng)基G2。再次培養(yǎng)3~4d后，統(tǒng)計囊胚個數(shù)并收集。

體細(xì)胞核移植胚胎培養(yǎng)：去除成熟卵母細(xì)胞第一極體，隨后注入供體細(xì)胞。顯微操作后，移入含10%FBS的M199培養(yǎng)基，在38.5℃，5%CO2條件下孵育0.5h，使用電融合儀進(jìn)行激活處理，移入6D孵育2.5h后，將重組胚胎在NCSU23培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d，隨后替換NC-SU23繼續(xù)培養(yǎng)3~5d，觀察胚胎的發(fā)育。

體內(nèi)胚胎的收集：從人工受精的母豬體內(nèi)收集第7~8d的囊胚，所有方法參照Stokes等。每天監(jiān)測母豬的發(fā)，將發(fā)日期作為0d，鑒定后的6、12和18h進(jìn)行人工受精。從子宮沖洗胚胎時使用預(yù)熱的含10%FBS的磷酸緩沖鹽溶液。

從豬胚胎分離胚胎多能干細(xì)胞：將去除透明帶的囊胚接種到絲裂 素C處理過的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上2~4d，囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)在3~5d后出現(xiàn)。待ICM大小適中時，用機械法分離細(xì)胞，重鋪到新的飼養(yǎng)層上，并使用不同的豬胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，胚胎多能干細(xì)胞克隆每5~7d使用機械法傳代。自增壓液氮罐