種質(zhì)資源設(shè)施保存之液氮超低溫保存法

種質(zhì)資源設(shè)施保存，是在人工控制環(huán)境下排除環(huán)境壓力和破壞，有效保存種質(zhì)材料的最安全的保存方式，它包括種子低溫保存、超低溫保存、種質(zhì)離體培養(yǎng)保存等技術(shù)方法。

下面，液氮罐技術(shù)人員就來(lái)詳細(xì)說(shuō)一下種質(zhì)液氮超低溫保存技術(shù)。 自增壓液氮罐

目前正在深入研究的超低溫保存方法，是長(zhǎng)期貯藏種質(zhì)的保存方法之一。這種方法是將種質(zhì)材料(包括種子、組織體等)保存在-196℃的液氮環(huán)境中，以達(dá)到更長(zhǎng)期的保持生命力或活力的目的。在液氮(-196℃)溫度下，細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝完全停止，能安全穩(wěn)定、節(jié)省空間、長(zhǎng)期有效地建立起離體基因庫(kù)，超低溫保存是長(zhǎng)期貯存植物種質(zhì)的最有效方法，甚至被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)生物種質(zhì)永久保存的唯一途徑。

種質(zhì)超低溫保存方法包括將保存材料變溫處理到-196℃條件下，并安全保存;在需要時(shí)將超低溫保存種質(zhì)的材料變溫到常溫條件下并恢復(fù)活力(或生命力)等一整套生物技術(shù)。

一般來(lái)說(shuō)，它包括以下6個(gè)步驟:

(1)前培養(yǎng):對(duì)培養(yǎng)體短期的生長(zhǎng)鍛煉處理，使其提高耐液氮保存的能力。

(2)防凍:培養(yǎng)體放入防凍液中，使其細(xì)胞降低冰點(diǎn)，減少因形成冰晶可能造成的損傷。

(3)變溫冷凍:按照不同變溫模式降溫冷凍，降溫速度依不同種質(zhì)材料采用特定的速度。

(4)超低溫保存:將冷凍材料保存到有效低溫環(huán)境中，以防止冰的游移或解體。

(5)解凍：一般認(rèn)為快速解凍更好。從液氮環(huán)境中取出封裝好的材料，與其容器一同放入+40℃的無(wú)菌水浴中，直到解凍后才回到室溫下，未封裝的材料放到20～30℃的液體培養(yǎng)基中解凍。

(6)生命力測(cè)定:如用TTC染色法等。

種質(zhì)材料的超低溫保存，傳統(tǒng)的技術(shù)有干凍法、預(yù)凍法和兩步法，上世紀(jì)80年代末和90個(gè)代初玻璃化法和包埋脫水法開(kāi)始應(yīng)用于植物材料的超低溫保存。

干凍法:利用無(wú)菌空氣流、干燥硅膠或飽和溶液表面的氣相等對(duì)種質(zhì)材料進(jìn)行脫水處理，然后快速將其投入液氮貯存。

預(yù)凍法:將種質(zhì)材料在添加保護(hù)劑(如蔗糖、二甲亞砜、甘油等)后置于低溫冰箱或液氮蒸汽箱(-10～-70℃)中冰凍若干小時(shí)后投入液氮貯存。自增壓液氮罐

兩步法:種質(zhì)材料在添加保護(hù)劑后，用程序降溫儀以某個(gè)速率(每分鐘0.1～0.5℃)降溫至轉(zhuǎn)移溫度(-40～-70℃)，然后投入液氮中貯存，兩步法較預(yù)凍法更為嚴(yán)格。

玻璃化法:種質(zhì)材料用高濃度的復(fù)合冰凍保護(hù)劑處理后，快速投入液氮貯存，細(xì)胞直接用極高濃度的保護(hù)劑脫水，在快速降溫時(shí)胞內(nèi)胞外都進(jìn)入玻璃化態(tài)，而不形成冰晶，從而避免了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞。包埋脫水法:莖尖、分生組織和體細(xì)胞胚等種質(zhì)材料用褐藻酸鈣包埋后，第一階段先在含高濃度蔗糖的培養(yǎng)基中脫水，第二階段用無(wú)菌空氣流或干燥硅膠脫水，然后投入液氮貯存。

超低溫保存技術(shù)在保存植物花粉、種子和胚、芽、莖尖、愈傷組織和懸浮細(xì)胞等方面有應(yīng)用和報(bào)道，目前主要應(yīng)用在作物、果樹(shù)和園林花卉種質(zhì)資源保存方面，林木種質(zhì)資源的超低溫保存也有少量報(bào)道。