研究豬胚胎多能樣干細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法

豬胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)自我更新和分化潛能，利用不同培養(yǎng)條件，從孤雌胚胎、細(xì)胞核移植胚胎和體內(nèi)受精胚胎中分離樣細(xì)胞。液氮容器

1.細(xì)胞培養(yǎng)用于核移植供體的豬胎兒成纖維細(xì)胞

從初生豬仔的耳部分離得到。細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM，15%胎牛血清，培養(yǎng)溫度為37℃，5%CO2。細(xì)胞凍存，使用0.25%(W/V)的胰蛋白酶消化，中和后離心200Xg，5min。將細(xì)胞重懸后并加入等量凍存液(40%DMEM，40%FBS和20%DMSO)，貯存在液氮中。

2.卵母細(xì)胞的收集和準(zhǔn)備

從屠宰場收集豬卵巢，保存在含有青/鏈霉素的生理鹽水中，運輸溫度32~38℃，3h內(nèi)運回實驗室。采用抽吸法采集卵巢卵母細(xì)胞。抽取3~6mm卵泡中的卵母細(xì)胞置于15mL離心管中，37℃水浴靜置數(shù)分鐘，待卵母細(xì)胞沉降后，用洗卵液洗2遍，顯微鏡下挑取顆粒細(xì)胞層達(dá)3層以上的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物(cumulusoocytecomplex，COCs)，然后將COCs轉(zhuǎn)入U型皿中培養(yǎng)42~44h，每孔加500µL成熟培養(yǎng)液，每孔放置50~70枚。

3.孤雌激活和胚胎培養(yǎng)

用電融合儀將成熟的卵母細(xì)胞進行電激活，漂洗后，將卵母細(xì)胞移至2mmol/L6D孵育2.5h。分別將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到胚胎培養(yǎng)基G1、NCSU23和豬受精卵培養(yǎng)基，24h后記錄卵裂率。3d后，將培養(yǎng)基G1中發(fā)育的胚胎移入囊胚培養(yǎng)基G2。再次培養(yǎng)3~4d后，統(tǒng)計囊胚個數(shù)并收集。

4.體細(xì)胞核移植胚胎培養(yǎng)

去除成熟卵母細(xì)胞第一極體，隨后注入供體細(xì)胞。顯微操作后，移入含10%FBS的M199培養(yǎng)基，在38.5℃，5%CO2條件下孵育0.5h，使用電融合儀進行激活處理，移入6D孵育2.5h后，將重組胚胎在NCSU23培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d，隨后替換NC-SU23繼續(xù)培養(yǎng)3~5d，觀察胚胎的發(fā)育。

5.體內(nèi)胚胎的收集

從人工受精的母豬體內(nèi)收集第7~8d的囊胚，所有方法參照Stokes等（2005)。每天監(jiān)測母豬的發(fā)情，將發(fā)情日期作為0d，鑒定發(fā)情后的6、12和18h進行人工受精。從子宮沖洗胚胎時使用預(yù)熱的含10%FBS的磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebuffersa-line，PBS)。

6.從豬胚胎分離胚胎多能干細(xì)胞

將去除透明帶的囊胚接種到絲裂霉素C(mi-tomycin-C)處理過的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonicfibroblastcells，MEFs)飼養(yǎng)層上2~4d，囊胚內(nèi)細(xì)胞團(innercellmass，ICM)在3~5d后出現(xiàn)。待ICM大小適中時，用機械法分離細(xì)胞，重鋪到新的飼養(yǎng)層上，并使用不同的豬胚胎干細(xì)胞(por-cineembryonicstemcells，pESCs)培養(yǎng)基(ESM1~ESM6，表1)，胚胎多能干細(xì)胞克隆每5~7d使用機械法傳代。液氮容器

7.免疫熒光檢測

使用4%多聚甲醛固定胚胎10min，PBS洗2次后，加入0.25%Triton-X室溫30min，PBS洗3次，1%BSA室溫封閉1h，4℃孵育一抗24h(1∶200，CDX2;1∶200NANOG)。PBS沖洗3次，孵育熒光標(biāo)記的二抗(1∶1000)室溫1h。PBS沖洗2次后，DAPI染色2min，PBS沖洗2次后在熒光顯微鏡下觀察照相。

8.qRT-PCR

使用0.5%鏈霉蛋白酶A去除豬胚胎的透明帶后，立刻加入5μL的裂解緩沖液(5mmol/L二硫蘇糖醇，1%NP-40，1U/uLRNA酶抑制劑)，冰上孵育30min。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將裂解液反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR體系：cDNA2μL，SYBRgreenmix12.5μL，上下游引物各0.3µmol/L0.5μL，ddH2O補充到25μL。反應(yīng)程序：95℃30s；95℃5s，60℃30s，共40個循環(huán)。