液氮罐低溫菌種保藏技術的原理及方法

　　菌種是主要的生物資源，也是食用菌生產首要的生產資料。一個優良的菌種被選育出來以后，必須保持其優良性狀不變或盡可能地少變慢變，才不至于降低生產性能，能長期在生產中使用。因此，菌種保藏在食用菌生產上具有重要的意義。

　　一、菌種保藏原理

　　菌種保藏的方法很多，但原理大同小異。首先要挑選優良純種。利用微生物的孢子、芽孢及營養體;其次，根據其生理、生化性，人為創造低溫、干燥或缺氧等條件，抑制微生物的代謝作用，使其生命活動降低到極低的程度或處于休眠狀態，從而延長菌種生命以及使菌種保持原有的性狀，防止變異。不管采用哪種保藏方法，在菌種保存過程中要求不死亡、不污染雜菌和不退化。

　　二、菌種保藏的方法

　　1、低溫定期移植保藏法。將需要保藏的菌種接種在適宜的斜面培養基上，適溫培養，當菌絲健壯地長滿斜面時取出，放在3-5℃低溫干燥處或4℃冰箱、冰柜中保藏，每隔4-6個月時間移植轉管一次，具體應根據菌種特性決定。保藏時要注意環境溫度不能太高，以防霉菌通過棉塞進入管內。因此，若用棉塞，可用干凈的硫酸紙或牛皮紙包扎棉塞，即可減少污染的機會，也可防止培養基干燥。除草菇菌種外，其他食用菌菌種都能采用此法保藏。

　　2、液體石蠟保藏法。取化學純液體石蠟(要求不含水分、不霉變)裝于三角瓶中加棉塞并包紙，在1公斤/平方厘米壓力下滅菌1小時，再放入40℃恒溫箱中數天，以蒸發其中水分，至石蠟油完全透明為止。將處理好的石蠟油移接在空白斜面上，28-30℃下培養2-3天，證明無雜菌生長方可使用。然后用無菌操作的方法把液體石蠟注入待保藏的斜面試管中。注入量以高出培養基斜面1-1.5厘米，塞上橡皮塞，用固體石蠟封口，直立于低溫干燥處保藏。保藏時間在一年以上，在低溫下，保藏時間還可延長。

　　3、沙土管保藏法。取河沙用水浸泡洗滌數次，過60目篩除去粗粒，再用10%鹽酸浸泡2-4小時，除去其中有機物質，再用水沖洗至流水的ph達到中性，烘干備用。同時取貧脊土或菜園土用水浸泡，使呈中性，沉淀后棄去上清液，烘干碾細，用100目篩子過篩，將處理好的沙與土以(2-4):1混勻，用磁鐵吸出其中的鐵質，然后分裝小試管或安瓿內，每管裝量0.5-2克，塞棉塞，用紙包扎滅菌(1.5公斤/平方厘米，1小時)，再干熱滅菌(160℃，2-3小時)1-2次，進行無菌檢驗，合格后使用。將已形成孢子的斜面菌種，在無菌條件下注入無菌水3-5毫升，刮菌苔，制成菌懸液，再用無菌吸管吸取菌液滴入砂土管中，以浸透砂土為止。將接種后的沙土管放入盛有干燥劑的真空干燥器內，接上真空泵抽氣數小時，至沙土干燥為止。真空干燥操作需在孢子接入后48小時內完成，以免孢子發芽。制備好的沙土管用石蠟封口，在低溫下可保藏2-10年。

　　4、濾紙片保藏法。取白色(收集深色孢子)或黑色(收集白色孢子)濾紙，剪成4×0.8厘米的小紙條，平鋪在培養皿中用紙包裹進行滅菌(1公斤/平方厘米，30分鐘)。采用鉤懸法收集孢子，讓孢子落在濾紙條上。將載有孢子的濾紙條放入保藏試管中，再將保藏試管放入干燥器中1-2天，除去濾紙水分，使濾紙水分含量達2%左右，然后低溫保藏。

　　5、自然基質保藏法

　　⑴麥粒保藏法：取無癟粒、無雜質的小麥淘洗干凈，浸泡12-15小時，加水煮沸15分鐘，繼續熱浸15分鐘，使麥粒脹而不破，瀝干水分攤開晾曬，使麥粒的含水量在25%左右。將碳酸鈣、石膏拌入熟麥粒中(麥粒、碳酸鈣、石膏比例為10公斤:133克:33克)，拌和均勻后裝入試管中，每管約2-3克，然后清洗試管，塞棉塞，滅菌1.5(1.5公斤/平方厘米，2小時)，經無菌檢查合格后備用，試管基質冷卻后接種，適溫培養，待菌絲長滿基質后用石蠟涂封棉塞，放低溫保藏。2年左右轉接一次。

　　⑵麩曲保藏法。取新鮮麩皮，過60目篩除去粗粒。將麩皮和自來水按1:1拌勻，裝入小試管，每管約裝1/3高度，加棉塞用紙包扎，高壓滅菌(1.5公斤/平方厘米，30分鐘)，經無菌檢查合格后備用，將生長在斜面培養基上的健壯菌種，移種至無菌麩曲管中，移種時注意盡管搗勻小試管中的麩皮，呈疏松狀態，在適溫下培養至菌絲長滿麩皮為止，將麩曲小管置干燥器中，在低溫或適溫下保藏。

　　6、生理鹽水保藏法。取純氯化鈉0.7-0.9克，放入100%毫升蒸餾水中，攪拌均勻分裝試管，每管5-10毫升，進行滅菌(1公斤/平方厘米，30分鐘)，經無菌檢查合格后備用，將待保藏的菌種接入馬鈴薯葡萄糖液體培養基中適溫振蕩培養5-7天。無菌操作吸取少許培養菌種注入經檢驗合格的生理鹽水試管中，塞上無菌橡皮塞，用石蠟涂封，在室溫或低溫保藏。

　　7、冷凍真空干燥法。將已培養、生長豐富的菌體或孢子懸浮于滅菌的血清、卵白、脫脂奶制成菌懸液，將懸液以無菌操作分裝于滅菌的玻璃安瓿瓶中，每管約0.3-0.5毫升，然后用耐壓橡皮管與冷凍干燥裝置連接，安瓿瓶放在冷凍槽中于-30℃至-40℃迅速冷凍，并在冷凍狀態下抽空干燥，并在真空狀態下熔封安瓿，在-20℃保存，一般可保存十年以上，但成本較高。

　　8、液氮超低溫保藏法。首先將要保藏的菌種制成菌懸液備用;其次，準備安瓿瓶，每瓶加入0.8毫升冷凍保護劑10%(體積比)甘油蒸餾水溶液，塞棉塞滅菌(1公斤/平方厘米，5分鐘)。無菌檢查后，接入要保藏的菌種，火焰熔封瓶口，檢查是否漏氣，將封好口的安瓿瓶放在凍結器內，以每分鐘下降1℃的速度緩慢降溫，使保藏品逐步均勻地凍結，直至-35℃，以后凍結速度就不需控制，安瓿凍結后立即放入液氮罐內，在-150至-196℃保藏，該法只有少數科研院所使用。